“应知应会”双荧光素酶报告系统原理与实验操作

“应知应会”双荧光素酶报告系统原理与实验操作

双荧光素酶报告系统原理与操作详解

双荧光素酶系统，利用萤火虫和海肾两种荧光素酶的独特特性，作为遗传报告基因，广泛应用于基因表达调控研究。其核心是两个酶的协同作用，萤火虫酶（Firefly luciferase）和海肾酶（Renilla luciferase）在特定条件下分别发光，提供实验数据的标准化和准确性。

萤火虫酶，无需后加工，通过翻译后立即激活，其发光反应需要重组酶、氧气、ATP和Mg2+，反应产生的黄色光可用于检测基因表达。作为外源基因的载体，可通过改造构建针对特定调控序列的重组质粒，如miRNA或lncRNA调控（图2）。

海肾酶则作为内参，用于数据归一化，它在实验中的稳定性有助于减少误差。通过与萤火虫酶信号对比，可以准确评估目的基因的表达效果（图4）。

实验流程包括构建重组质粒（如pGL3-Basic+，图6和7），工具细胞的铺板与转染，然后通过收集荧光数据（图8）进行定量分析。注意事项包括选择高质量的DNA模板，优化细胞状态和操作条件，以及正确处理可能的信号过高或过低问题（图5）。

在遇到问题时，如启动子活性低或荧光值过高，需要调整细胞培养条件、控制检测时间，以确保数据的准确性和可靠性。双荧光素酶报告系统是理解基因表达调控的重要工具，合理操作和解读数据是关键。2024-08-09