干货 | 基因功能研究之双荧光素酶报告分析

双荧光素酶是单荧光素酶的升级版,包括萤火虫荧光素酶与海肾荧光素酶。海肾荧光素酶作为内参,能归一化实验数据。报告基因应具备易克隆、表达迅速、不干扰目的细胞、检测范围宽、不影响正常生理活动、表达产物易于检测等特点。萤火虫荧光素酶催化反应产生黄绿色荧光,海肾荧光素酶则产生蓝色荧光。双荧光素...
干货 | 基因功能研究之双荧光素酶报告分析
荧光素酶报告基因的演化与发展

荧光素酶,一种催化荧光底物产生荧光的蛋白酶,最初源于自然界发光生物,虽哺乳细胞无内源性荧光素酶,但通过提取自不同生物的荧光素酶,如萤火虫荧光素酶、细菌荧光素酶等,丰富了荧光素酶资源。1960年,Cormier等研究者从海肾中提取了海肾荧光素酶,为科研应用奠定了基础。1996年,Promega公司正式发布双荧光素酶报告基因系统,结合萤火虫荧光素酶和海洋腔肠荧光素酶,实现生物传感器技术的突破。

双荧光素酶报告基因检测原理

双荧光素酶是单荧光素酶的升级版,包括萤火虫荧光素酶与海肾荧光素酶。海肾荧光素酶作为内参,能归一化实验数据。报告基因应具备易克隆、表达迅速、不干扰目的细胞、检测范围宽、不影响正常生理活动、表达产物易于检测等特点。萤火虫荧光素酶催化反应产生黄绿色荧光,海肾荧光素酶则产生蓝色荧光。

双荧光素酶应用

用于转录因子调控研究、microRNA与mRNA、lncRNA靶向互作分析、启动子结构研究等。通过构建特定报告基因载体与目的基因结合,共转染细胞,检测荧光强度,判断调控效果。

双荧光素酶检测实验步骤

步骤包括质粒构建、细胞转染、报告基因检测与数据分析。质粒构建时选择相应骨架载体,加入启动子或转录因子序列。细胞转染需根据实验目的选择瞬时或稳定转染方法,并保持主报告基因与内参基因比例适宜。报告基因检测通过荧光计数仪测定活性。数据分析计算相对荧光强度,评估转录因子或调控分子的作用效果。2024-10-09
cdw 阅读 16 次 更新于 2025-08-11 14:19:02 我来答关注问题0
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