接着进行细胞裂解及荧光检测，检测过程包括使用裂解Buffer、萤火虫荧光素酶反应液、海肾荧光素酶反应液，记录荧光值。案例分析 案例1：检测ZmNAC49是ZmMUTE转录的激活子还是抑制子。实验方案包括构建报告基因载体及靶基因表达载体，载体构建过程中推荐使用同源重组方法。将载体转化至烟草叶片中，测定LUC和REN...
干货 | 双荧光素酶报告基因检测如何助力转录因子研究？
双荧光素酶报告系统
双荧光素酶报告基因检测系统（Dual-Luciferase Reporter Assay）由萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶组成。其中，萤火虫荧光素酶在底物充足时，产生的荧光量与酶活性成正比。海肾荧光素酶则作为转染的内参，以减少细胞数量和转染效率对实验结果的影响。通过特定荧光检测仪检测荧光量，从而判断酶的活性，反映基因间的关系。
双荧光素酶报告基因在转录因子研究中的应用
转录因子，即反式作用因子，是能与基因的顺式作用元件特异性相互作用，调节基因转录的DNA结合蛋白。双荧光素酶报告基因检测时，通常分为研究转录因子是增强子还是抑制子，或研究其他因素（如磷酸化、分子物质等）对转录因子活性的影响。这一过程中通常涉及3个质粒：报告基因质粒、转录因子表达质粒和内参质粒。
实验流程
查询靶基因的转录调控作用位点，通常需要构建重组载体，根据研究目的构建报告基因载体及表达载体。转染步骤选择合适的转染方法，将实验组（报告基因载体/表达载体/PRC-TK载体）及对照组（报告基因载体/表达空载体/PRC-TK载体）进行转染。接着进行细胞裂解及荧光检测，检测过程包括使用裂解Buffer、萤火虫荧光素酶反应液、海肾荧光素酶反应液，记录荧光值。
案例分析
案例1：检测ZmNAC49是ZmMUTE转录的激活子还是抑制子。实验方案包括构建报告基因载体及靶基因表达载体，载体构建过程中推荐使用同源重组方法。将载体转化至烟草叶片中，测定LUC和REN信号，结果表明ZmNAC49作为ZmMUTE的转录抑制因子。
案例2：研究nsp15对转录因子NF-kB活性的影响。构建重组载体，在LLC-PK1及HEK-293T细胞中进行转染，添加不同浓度的nsp15，结果发现nsp15显著抑制SEV诱导的NF-kB激活，并且抑制程度与浓度呈正比。2024-10-13
