在进行 miRNA 与靶基因互作研究时，关键在于构建适当的双荧光素酶报告基因载体。此类载体通常包含萤火虫荧光素酶基因和海肾荧光素酶基因，各自带有启动子和终止位点，确保两者独立表达且互不影响。萤火虫荧光素酶通过催化萤光素产生荧光信号，而海肾荧光素酶则催化腔肠素产生荧光信号。通过改造载体，将目的...
干货 | 如何用双荧光素酶报告基因研究miRNA与靶基因互作
构建载体与转染组别设计
在进行 miRNA 与靶基因互作研究时，关键在于构建适当的双荧光素酶报告基因载体。此类载体通常包含萤火虫荧光素酶基因和海肾荧光素酶基因，各自带有启动子和终止位点，确保两者独立表达且互不影响。萤火虫荧光素酶通过催化萤光素产生荧光信号，而海肾荧光素酶则催化腔肠素产生荧光信号。通过改造载体，将目的基因的 3’ UTR 区域与萤火虫荧光素酶基因相连，构建后与其他质粒或物质共转染细胞，培养一段时间后裂解细胞，检测萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶的表达水平。海肾荧光素酶的表达作为转染效率的内参，消除孔间细胞数量和转染效率的差异，而萤火虫荧光素酶与海肾荧光素酶的荧光强度比值则可作为报告基因活性的检测指标。
miRNA 与靶基因互作原理
miRNA 是一类在植物和动物细胞中自然产生的 18-25 个核苷酸的非编码单链 RNA，其生成由长约 75 nt 的茎环结构前体 RNA 经 Dicer RNase 酶切割而成。这些 miRNA 通过与靶 mRNA 的 3’ UTR 区域的碱基互补配对识别靶基因，根据互补程度指导沉默复合体降解靶基因或阻碍 mRNA 的翻译，从而发挥调控作用。
实验设计流程
实验设计主要包括靶基因预测、提取基因组 DNA、引物设计、目的片段扩增、载体构建、相关材料准备以及转染组别设置等步骤。具体操作细节可参考转染试剂说明书。转染后通过双荧光素酶报告基因检测系统进行检测，检测时每个样本建议进行至少三个技术重复。数据处理包括去除背景、数据归一化、技术重复取平均值、生物学重复取平均值以及计算倍数变化等步骤。通过对比实验组与对照组的荧光素酶活性变化，分析 miRNA 对靶基因表达的调控作用。
数据分析与结果解读
在数据分析阶段，首先去除空白对照中的背景值，将萤火虫荧光素酶数值减去空白对照值，海肾荧光素酶数值也做相同处理。接着，将去除背景后的萤火虫荧光素酶数值除以去除背景后的海肾荧光素酶数值，得到归一化后的数据。然后对同一生物学重复下的三个技术重复取平均值，再将所有生物学重复的平均值进行平均，以获得最终数据。通过比较实验组与对照组的荧光素酶活性变化，可以判断 miRNA 对靶基因表达的影响程度。
实验结果通常以图表形式展示，直观反映 miRNA 对靶基因表达的调控作用。例如，在携带野生型质粒和 miRNA 模拟物的实验组中，荧光素酶活性显著下降，而在携带突变型质粒的实验组中则无显著变化。这表明 miRNA 通过结合靶基因 3’ UTR 区域抑制基因表达。2024-09-16
