双荧光素酶报告基因检测系统具备定量、高灵敏度及低背景的特点。实验中，双报告基因检测系统可以研究miRNA与3’UTR的相互作用、转录因子与启动子的相互作用。验证大鼠miR-1与靶基因ATG13 3’UTR是否作用，并确定作用位点，构建luc-3’-UTR-WT载体和luc-3’-UTR-mut载体，与海肾载体及miRNA mimics共...
实验分享▏用数据说话，教你做双荧光素酶报告基因实验
验证miRNA与lncRNA的作用机制，分析确认miRNA的靶基因，确定结合位点的序列，这些问题都能通过双荧光素酶报告基因检测系统来解决。该系统基于荧光素酶的发光原理，包括萤火虫荧光素酶（Firefly luciferase）和海肾荧光素酶（Renilla luciferase）。两者催化各自的底物发生氧化作用产生生物荧光，荧光数值大小表示酶的表达量。Firefly luciferase和Renilla luciferase被称为报告基因，用于监控、证实分子间的相互作用。将靶基因的转录调控元件或启动子区克隆至Firefly luciferase基因的上下游，研究启动子的强弱和转录因子的作用或miRNA的调控作用。同时，引入包含Renilla luciferase基因的TK载体作为内参，消除转染等因素带来的误差。双荧光素酶报告基因检测系统具备定量、高灵敏度及低背景的特点。
实验中，双报告基因检测系统可以研究miRNA与3’UTR的相互作用、转录因子与启动子的相互作用。验证大鼠miR-1与靶基因ATG13 3’UTR是否作用，并确定作用位点，构建luc-3’-UTR-WT载体和luc-3’-UTR-mut载体，与海肾载体及miRNA mimics共转染293T细胞后，使用双荧光素酶报告基因检测系统检测。研究转录因子IRF3对IFN-β启动子的调控作用，构建Luc-IFN-β启动子载体和IRF3的过表达载体，共转染后，使用双荧光素酶报告基因检测系统分析荧光值差异。
获取好数据的方法是关键，避免数值太低，启动子活性、转染效率、裂解、底物、操作等因素需关注；复孔差异大时，增加复孔数量，控制裂解、加样准确性，保证样本均一性，避免差异影响结果。通过这些方法，实验者能够有效利用双荧光素酶报告基因检测系统进行科研工作，提升实验数据的准确性和可靠性。2024-11-24
