双荧光素酶报告基因系统检测原理是什么？

双荧光素酶报告基因系统检测原理是什么？

荧光素酶作为一种出色的报告基因，以其灵敏度高、操作简便、可定量检测等优势成为科研中的重要工具。其中，萤火虫荧光素酶（Firefly luciferase，FLUC）和海肾荧光素酶（Renilla luciferase，RLUC）是应用最为广泛的两种荧光素酶。这两种酶催化发光原理不同，萤火虫荧光素酶在ATP、Mg2+和O2条件下催化荧光素氧化产生黄绿光，波长为540-600nm，而海肾荧光素酶仅需O2催化腔肠素氧化发出蓝光，波长为460-540nm。由于催化底物和发光颜色不同且光吸收波长不同，双荧光素酶报告基因系统得以在互不干扰的情况下进行检测。在哺乳动物体内，两种酶均无内源性表达，这使得双荧光素酶报告基因系统在基因转录调控、启动子结构分析、启动子SNP分析和非编码RNA靶向互作等研究中得到广泛应用。

双荧光素酶报告基因系统的检测方法通常包括将萤火虫荧光素酶报告基因质粒与海肾荧光素酶基因质粒共转染细胞，或者将两种报告基因构建在同一载体上，用不同的启动子启动其表达。通过计算萤火虫荧光素酶检测值与海肾荧光素酶检测值的比值（Firefly Luciferase/ Renilla Luciferase），可分析荧光素酶的表达水平。

双荧光素酶报告基因系统的应用场景广泛。例如，在启动子与转录因子互作检测中，将靶启动子片段插入到萤火虫荧光素酶表达序列上游，构建实验报告基因质粒，与要检测的转录因子表达质粒共转染相关细胞。通过检测荧光强度判断转录因子是否与该启动子存在相互作用。若转录因子能够激活靶启动子，则萤火虫荧光素酶的表达水平会与转录因子的作用强度成正比。

在miRNA-靶基因调控验证中，利用miRNA通过识别mRNA的3’UTR区，诱导细胞内沉默复合体介导的mRNA降解或抑制翻译的过程。将野生型或突变型待测靶基因的3’UTR序列构建至萤火虫荧光素酶基因的3’端，与miRNA在细胞内共表达，通过比较萤火虫荧光素酶报告基因表达活性的改变，验证miRNA对靶基因的调控作用。若萤光素酶活性降低，则提示miRNA可能参与抑制靶基因的表达。

整个服务流程包括载体构建、细胞转染、荧光检测和数据分析，提供了一套系统、高效的研究工具，为科研工作者提供有力支持。通过双荧光素酶报告基因系统，研究人员能够深入探讨基因调控机制，为生物学、医学等领域的发展提供科学依据。2024-11-03